Fotomicrografia
Tecniche di illuminazione
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Introduzione
Recentemente in molti mi hanno chiesto informazioni sulle tecniche e sulle attrezzature che utilizzo per realizzare le fotomicrografie.
Con questo articolo ti parlo delle tecniche che uso per illuminare i campioni che fotografo con il microscopio. In quest'altro articolo approfondisco il tema delle attrezzature.
Parto con una breve premessa sull'attrezzatura che uso, riservandomi futuri approfondimenti. Si tratta di un microscopio biologico trinoculare. Il microscopio è equipaggiato con cinque obiettivi con attacco RMS:
- 4X/0.10 - 160/-
- 10X/0.25 - 160/0.17
- 20X/0.40 - 160/0.17
- 40X/0.65 - 160/0.17
- 100X/1.25 Oil - 160/0.17
La testa trinoculare è del tipo Siedentopf, con due oculari 10X/20mm. Il condensatore è un semplice Abbe con diaframma a iride e porta filtri da 32 mm. Sul terzo tubo della testa è montato un adattatore fotografico autocostruito. All'estremità superiore dell'adattatore vi è un attacco per reflex M42x1 e un anello adattatore per il sistema EOS. All'interno dell'adattatore autocostruito ho posizionato un oculare 10X/20mm (identico ai due oculari che uso in visuale). L'oculare aggiunge un ulteriore ingrandimento all'immagine proiettata sul sensore della macchina fotografica. La reflex viene montata senza obiettivo. Tra reflex e adattatore vi è un set di tubi di prolunga.
Il sistema di illuminazione di serie consta di una lampadina alogena da 20W - 12V, un filtro anticalore azzurro, il collettore (sistema di lenti) e il diaframma di campo. Recentemente ho modificato il sistema di illuminazione sostituendo la lampadina alogena con una lampadina LED da 3W - 12V (stesso attacco G4). L'illuminazione si può regolare con un dimmer. La lampadina LED non si riscalda molto e, quindi, ho rimosso il filtro anticalore.
Con questa modifica ho più luce a disposizione e i risultati fotografici sono migliorati di molto, grazie anche al più ridotto spettro di emissione del LED rispetto all'alogena.
Per illuminare i soggetti uso quattro diverse tecniche di illuminazione:
- campo chiaro;
- illuminazione obliqua;
- campo scuro;
- luce incidente.
Tecnica del campo chiaro
Per le fotografie in campo chiaro uso la ben nota tecnica di Köhler. Proverò a dartene una descrizione sommaria e molto schematica: aprendo in maniera opportuna entrambi i diaframmi, quello del condensatore e quello di campo, e posizionando il condensatore alla giusta altezza, perfettamente centrato, puoi ottenere una illuminazione uniforme su tutto il campo e concentrare il fascio luminoso sul "piano" del soggetto. Con questa tecnica, soprattutto, sfrutti l'intera apertura dell'obiettivo e, quindi, il suo potere risolvente.
L'illuminazione in campo chiaro di Köhler è importante nella fotomicrografia. Il microscopio deve essere dotato del diaframma di campo (posizionato sopra il sistema di illuminazione) e di un condensatore centrabile e regolabile in altezza. Anche il condensatore deve essere dotato del diaframma (detto anche diaframma di apertura).
Dettaglio della testa di una pulce d'acqua. Fotografia in campo chiaro.
Obiettivo 10X - 1/60 sec. - 200 ISO
Sezione tasversale del fusticino di Urtica dioica. Campo Chiaro.
Obiettivo 10X - 1/90 sec. - 200 ISO
Tecnica dell'illuminazione obliqua
Per l'illuminazione obliqua utilizzo un metodo fai-da-te: un disco di plastica trasparente su cui è disegnata una sagoma nera di forma opportuna, che viene collocato nel porta filtri del condensatore. Il condensatore rimane centrato, posizionato alla minima distanza dal vetrino portaoggetti (in pratica tutto alzato), con il diaframma completamente aperto.
La sagoma è pensata per gli obiettivi dal 10X in su. Utilizzando il 4X, nel campo si nota una zona scura (bluastra) e una zona chiara. Tuttavia risalta l'effetto di tridimensionalità dovuto al gioco di luci e ombre.
Questa tecnica dona agli oggetti un effetto di tridimensionalità dovuto alla presenza di parti più illuminate e ombre, mettendo in evidenza dettagli che, altrimenti, non sarebbero visibili o lo sarebbero poco. Ciò è possibile poiché la sagoma nera scherma una parte dei raggi di luce, creando ombre, e lascia passare il resto.
In alcune delle fotografie che seguono, realizzate con la tecnica dell'illuminazione obliqua, ho adoperato anche un filtro polarizzatore posizionato sopra il diaframma di campo e un pezzo di plastica trasparente posizionato sopra il filtro polarizzatore. Ruotando polarizzatore e plastica trasparente, per tentativi, si ottengono curiosi effetti di luce. Inoltre, anche con l'obiettivo 10X viene messa in risalto la parte scura.
Unaa pulce d'acqua fotografata con illuminazione obliqua e filtro polarizzatore.
Obiettivo 4X, 1/45 sec. - 200 ISO
Dettaglio della testa di una pulce d'acqua. Illuminazione obliqua e polarizzatore.
Obiettivo 10X - 1/15 sec. - 200 ISO
Diatomea del genere Navicula. Illuminazione obliqua.
Obiettivo 40X - 1/45 sec. - 400 ISO
Nauplio. Stadio larvale di un crostaceo microscopico (molto probabilmente Copepode). Illuminazione obliqua.
Obiettivo 20X - 1/20 sec. - 100 ISO
Il condensatore di Abbe con il suo porta filtri e il "filtro" per l'illuminazione obliqua.
L'illuminazione obliqua ricrea un effetto che ricorda quello di un'importante tecnica conosciuta come DIC (Differential Interference Contrast, ovvero Contrasto d'Interferenza Differenziale), o anche di altre tecniche simili, per la quale sono richiesti specifici costosi accessori e microscopi predisposti per accoglierli. Con l'illuminazione obliqua, e con tecniche fai-da-te simili (su cui è possibile un'ampia possibilità di sperimentazione), puoi conseguire risultati molto interessanti a costi praticamente nulli.
Tecnica del campo scuro
Per realizzare fotografie in campo scuro non uso l'apposito condensatore ma un set di filtri fai-da-te. Si tratta di cinque dischi di plastica trasparente (32 mm di diametro) su ognuno dei quali è incollato al centro un dischetto nero opaco ben più piccolo. I dischetti neri hanno cinque diversi diametri, dal più piccolo (8 mm) al più grande (16 mm). Ogni filtro si abbina a uno o più obiettivi, ma non è una regola e si può sperimentare in libertà. Come per l'illuminazione obliqua, i filtri vanno posizionati nel porta filtri del condensatore e questo va sollevato al massimo.
Con questa tecnica lo sfondo appare nero, mentre il soggetto è luminoso. Ogni oggetto inquadrato, anche le "particelle" più piccole, brillano.
Anche per la prima delle fotografie che seguono mi sono divertito a sperimentare l'uso del polarizzatore e della plastica trasparente.
Dettaglio della testa di una pulce d'acqua. Fotografia in campo scuro e polarizzatore.
Obiettivo 10X - 1/8 sec. - 400 ISO
Chiocciolina d'acqua dolce. Campo scuro.
Obiettivo 4X - 0.7 sec. - 400 ISO
Tardigrado. Campo scuro.
Obiettivo 10X - 1/10 sec. - 200 ISO
Il set di "filtri" per il campo scuro.
Confronto tra le tecniche (campo chiaro, illuminazione obliqua e campo scuro)
Le tre tecniche sopra descritte non possono essere impiegate indifferentemente su un determinato oggetto. Ogni tecnica, infatti, mette in evidenza aspetti diversi dell'oggetto, con risultati profondamente diversi e non sempre gradevoli.
Occorre provare e scegliere la tecnica più adatta, non soltanto sotto il profilo estetico! Guarda, per esempio, le tre fotografie che seguono:
Alga coniugatoficea del genere Cosmarium. Campo chiaro.
Obiettivo 40X - 1/30 sec. - 200 ISO
Alga coniugatoficea del genere Cosmarium. Illuminazione obliqua.
Obiettivo 40X - 1/20 sec. - 200 ISO
Alga coniugatoficea del genere Cosmarium. Campo scuro e filtro azzurro.
Obiettivo 40X - 1/10 sec. - 200 ISO
Si tratta di alghe coniugate del genere Cosmarium. Nella prima e nella terza fotografia è ripresa la stessa alga. Come vedi i risultati sono molto diversi. Sicuramente il maggior numero di dettagli emerge con l'illuminazione obliqua, invece in campo scuro tutti gli organuli dell'alga appaiono luminosi e, quindi, indistinti. Nelle immagini della pulce d'acqua e della chiocciolina, invece, il campo scuro ha dato risultati migliori.
Tecnica della luce incidente (o riflessa)
La tecnica della luce incidente differisce da tutte le altre in quanto non si usa il sistema di illuminazione del microscopio, posizionato sotto il tavolino, ma sorgenti di luce esterne che illuminano l'oggetto dall'alto e/o lateralmente.
Con questa tecnica, molto usata con i microscopi stereoscopici, l'oggetto può essere anche opaco e spesso: un fiore, un cristallo, etc. Proprio per tal motivo con i microscopi biologici è possibile usare questa tecnica solo a bassi ingrandimenti. Infatti usando un obiettivo a forte ingrandimento, l'estrema vicinanza dell'obiettivo all'oggetto impedisce che questo venga raggiunto dalla luce! Con questa tecnica uso soltanto l'obiettivo 4X, la cui distanza dall'oggetto mi consente di illuminarlo in maniera ottimale. A tal fine sistemo 2 o 3 faretti LED ai lati del microscopio, puntandoli verso l'oggetto, controllando l'effetto che ottengo. I faretti sono montati su sostegni per chimica, orientabili. Tra i faretti e l'oggetto sistemo dei fogli diffusori per ottenere una luce diffusa e uniforme.
Poiché gli oggetti sono voluminosi, adotto la tecnica del focus stacking che mi consente di ottenere un'immagine finale completamente a fuoco (almeno sulle parti che decido di avere a fuoco).
Se voglio che lo sfondo sia luminoso o colorato, mi basta accendere il sistema di illuminazione del microscopio e regolare l'altezza del condensatore. Posso anche aggiungere un filtro colorato sopra il sistema di illuminazione del microscopio. Con appositi fogli di plastica colorati, trasparenti, posso filtrare la luce dei faretti LED.
Se voglio che lo sfondo sia nero mi basta tenere spento il microscopio e abbassare il condensatore per evitare che rifletta verso l'alto la luce dei faretti.
Vediamo insieme le due fotografie che seguono:
Stami del fiore di Reseda alba (dettaglio delle antere). Luce incidente.
Obiettivo 4X - Focus stacking di 22 immagini - 1/30 sec. - 100 ISO
Luce del microscopio accesa, con filtro azzurro.
Semi di Linaria colorati. Luce incidente.
Obiettivo 4X - Focus stacking di 12 immagini - da 4 a 10 sec. - 100 ISO
Luce del microscopio spenta.
La prima fotografia mostra il dettaglio delle antere di un fiore di Reseda alba. Lo sfondo è luminoso e leggermente azzurrino poiché ho acceso la luce del microscopio e l'ho filtrata con un filtro azzurro. Ho usato la tecnica del focus stacking e l'esposizione manuale, con 1/30 di secondo per tutte le fotografie.
La seconda fotografia mostra i semi della Linaria. I semi hanno dimensioni di circa 1 mm e li ho colorati con coloranti diversi (blu di metilene, verde naphtol, eosina, giallo-arancio di anilina, verde brillante di anilina, fucsina fenica, violetto di genziana, curcuma e carminio). Lo sfondo è nero poiché ho tenuto spenta la luce del microscopio e ho abbassato del tutto il condensatore (eventualmente puoi mettere sotto il soggetto un foglio nero). Ho usato la tecnica del focus stacking e l'esposizione automatica a priorità dei diaframmi. La macchina ha impostato in automatico tempi di posa da 4 a 10 secondi (evidentemente la sfocatura di alcune parti luminose ha influito sull'esposimetro).
Ti segnalo che alcuni microscopi sono predisposti per l'osservazione e la fotografia in luce incidente (episcopia). Questi microscopi utilizzano una apposita sorgente di luce e illuminano il campione dall'alto, facendo passare la luce attraverso gli obiettivi, oppure impiegano speciali obiettivi per episcopia. Questi microscopi trovano largo impiego nel campo della metallurgia, della mineralogia, etc.
Ti ricordo che puoi trovare altre fotomicrografie nel mio portfolio.
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